Side 20

n BIOTEKNOLOGI Figur 2. Vores nye metode kan identificere de resistensgener, der er til stede i en prøve fra en patient. langt hurtigere end at dyrke de patogene mikroorganismer. Det næste trin er at forstå og identificere nøjagtigt hvilke gener, der forårsager antibiotikaresistensen. Denne viden er vigtig for at kunne skræddersy behandlingen. Hurtig og billig sekventering åbner nye muligheder Den mest præcise måde at identificere resistensgener på er ved hjælp af DNA-sekventering. I dag findes der et utal af forskellige teknologier til sekventering af DNA, hvor den ældste metode kaldes Sanger-sekventering – opkaldt efter Nobelprisvinderen Fred Sanger. Selvom Sanger-sekventering er meget præcist, er det dyrt at opskalere. Nye teknologier, kaldet Next Generation Sequencing (NGS), er kommet ind på markedet og tilbydes af virksomheder som Illumina og PacBio. Med NGS kan man sekventere store mængder DNA på kort tid og en af de nyeste kommercielt tilgængelige NGS-teknologier er nanoporesekventering, der tilbydes af Oxford Nanopore Technologies. Deres nanopore-sekventeringsmaskine, MinION, koster i omegnen af 1.000 dollars. Til sammenligning koster en konventio- nel NGS-maskine op mod 50.000-1.000.000 dollars. Den lave indkøbspris betyder bl.a., at nanopore-sekventering også kan udføres i ulande. I forsøget undersøgte vi fem fækale prøver fra en intensivpatient, der havde gennemgået en lungetransplantation på grund af lungesygdommen KOL. Under opholdet på hospitalet blev patienten behandlet forebyggende med fem forskellige antibiotika. Vi anvendte funktionel metagenomik for at få DNA – og dermed identificere puljen af resistensgener – fra de fækale prøver. Derefter sekventerede vi DNA’et fra de synlige bakteriekolonier med MinION nanopore-sekventeringsmaskinen. Til sidst anvendte vi en bioinformatisk analysemetode, som vi udviklede Figur 3. Dette er et billede af en af vores laboratorie-E. coli-stammer, der indeholder metagenomisk DNA, og som er dyrket i en petriskål med et bestemt antibiotikum. 20 n Sådan virker nanopore-sekventering MinION sekventeringsmaskinen (en enhed på størrelse med en USB-nøgle) virker ved at detektere variationer i elektroniske strømme, når DNA-baserne glider forbi: 1. F or at finde resistomet isoleres først alt det DNA fra mikroberne, der er involveret i at give resistens. DNA’et nedbrydes til to strenge, og en enkelt streng føres ned gennem MinION-sekventeringsmaskinen, som indeholder såkaldte nanoporer. 2. H ver nanopore er kun et par nano-meter bred og kan kun indeholde én DNA-streng ad gangen. 3. Der tilføres en elektrisk strøm til maskinen, og hver nanopore måler nu ændringerne i de elektriske impulser fra DNA’ets forskellige byggesten, som er placeret inde i poren. 4. D e elektriske impulser sendes til en computer, hvor avanceret software oversætter signalerne til den genetiske kode. 5. Når alle DNA-strenge i prøven har passeret gennem nanoporen, samler computeren alle generne i resistomet. dansk kemi, 98, nr. 6/7, 2017

Side 21

BIOTEKNOLOGI n til netop denne teknologi. Den bioinformatiske analysemetode er tilgængelig på https://github.com/EvdH0/poreFUME_paper, så alle kan efterprøve analysen. Nøjagtigheden af resistensgen-identifikationen sammenlignet med Sanger-metoden var ca. 97%. Alligevel kunne vi med metoden identificere de 26 forskellige resistensgener, der var til stede i patientens tarm. Det viste sig, at nogle af generne gav resistens over for nogle af de antibiotika, som patienten blev behandlet med under opholdet på intensivafdelingen. Resultaterne og metoden blev offentliggjort i januar i det videnskabelige tidsskrift Nucleic Acid Research [2]. Nanopore-sekventering kan føre til personlig behandling Kombinationen af funktionel metagenomik og nanoporesekventering er et lovende alternativ til andre sekventeringsteknologier og kan bruges til hurtigt at give en resistensgen-profil, f.eks. i tarmsystemet. En sådan profil kan føre til personlig antibiotikabehandling hos patienter med høj risiko for at udvikle resistens. Med mere målrettet behandling, hvor lægerne udvælger medicin, der ikke ”tricker” bestemte resistensgener i tarmen, vil man få en langt mere effektiv behandling og formentligt undgå at accelerere udviklingen af antibiotikaresistens. For at personlig behandling skal blive virkelighed, er der dog brug for flere undersøgelser af, hvordan antibiotikabehandling påvirker resistens-profilen samt hvordan den efterfølgende personlige behandling påvirker resistens-profilen. Men konklusionen lader til at være, at nanopore-sekventering er et effektivt værktøj til at udføre sådanne undersøgelser hurtigt og effektivt. E-mail: Eric van der Helm: evand@biosustain.dtu.dk Anne Lykke: annly@biosustain.dtu.dk Referencer 1. S ender, R., Fuchs, S. & Milo, R. Revised Estimates for the Number of Human and Bacteria Cells in the Body. PLOS Biol. 14, 1-14 (2016). 2. v an der Helm, E. et al. Rapid resistome mapping using nanopore sequencing. Nucleic Acids Res. (2017). doi:10.1093/nar/gkw1328 LabDays 2017 Fagmesse for laboratorieteknik n LSB Temamøde n Laboratorieudstyr n Diagnostik n Bioteknologi n Forskning n Kvalitetskontrol n Fagkonferencer n Over 85 udstillere Århus 20. - 21. september labdays.dk dansk kemi, 98, nr. 6/7, 2017 21

    ...