Side 12

n ANALYTISK KEMI/MEDICINALKEMI Billeddannende massespektrometri - stofspecifik imaging af lægemidler og metabolitter i væv Billeddannende massespektrometri gør det muligt at følge lægemidler og deres omdannelse i organismen. Metoden er med succes benyttet til at følge et lægemiddels fordeling og metabolisme i en mus og et lægemiddels penetration gennem hud. Af Christian Janfelt, Institut for Farmaci, Københavns Universitet Billeddannende massespektrometri (MSI, eng: Mass spectrometry imaging) er en særlig disciplin inden for massespektrometri, hvor man udnytter ioniseringsteknikker, der kan ionisere stoffer direkte fra overflader til at optage billeder, som viser fordelingen af stoffer på en overflade. Idet billederne baserer sig på data opnået med massespektrometri, deler MSI en række fordele med mere konventionelle MS-teknikker såsom LC-MS, nemlig en høj grad af selektivitet i analysen kombineret med muligheden for at identificere ukendte stoffer i forbindelse med analysen samt muligheden for at måle på prøver uden at skulle tænke på forudgående mærkning med f.eks. fluorescens eller radioaktivitet. MSI er tidligere beskrevet i to artikler i Dansk Kemi, som beskrev anvendelsen inden for bl.a. planteanalyse [1] og vævsprøver [2], sidstnævnte dog med vægt på analysen af endogene stoffer i væv. I denne artikel vil vi fokusere på brugen af MSI til at følge lægemidler og deres omdannelse i organismen med udgangspunkt i to studier af hhv. et lægemiddels fordeling i en mus [3] og et lægemiddels penetration gennem hud [4]. Hvorfor undersøge fordelingen af lægemidler? I udviklingen af lægemidler er det af største betydning at kunne undersøge lægemidlers optagelse og kunne redegøre for deres fordeling og omdannelse i organismen. Dette har betydning i discovery-fasen, hvor forskellige lægemiddelkandidater undersøges, og der søges svar på, om lægemidlet er i stand til at trænge igennem de forskellige barrierer i kroppen (f.eks. tarmvæggen eller blod-hjerne barrieren), om det nedbrydes i leveren, inden det har nået at udøve sin effekt, og hvor i organismen de forskellige metabolitter af lægemidlet dannes. Det er også af betydning i development-fasen, hvor det valgte lægemiddel skal formuleres (f.eks. som tablet eller i en creme), hvor den valgte formulering kan have betydning for, hvorledes det aktive stof frigives til organismen. Der er en udbredt brug af radioaktivt mærkede lægemidler i distributions- og metabolismestudier, idet den detekterede radioaktivitet i f.eks. plasma- og urinprøver kan henføres til det oprindeligt indgivne lægemiddel eller metabolitter af dette. Ligeledes bliver fordelingen af lægemiddel i forsøgsdyr ofte undersøgt ved brug af Kvantitativ whole-body autoradiografi (QWBA), hvor en radioaktivt mærket udgave af lægemidlet (f.eks. ved udskiftning af et af carbon-atomerne med et 14C) Figur 1. Princippet i billeddannende massespektrometri (her vist med data fra et billede af et blad fra prikbladet perikon). Prøven scannes således, at der optages et massespektrum i hvert punkt i prøven; hvert massespektrum ender som en pixel i det endelige billede (a). For hver top i massespektrene (b) kan der ud fra intensiteterne af den pågældende masse genereres et billede, som viser fordelingen af stoffet (c). Disse billeder kan kombineres ved at bruge forskellige farver til hvert af stofferne, hvorved der opnås en meget nøje sammenligning af fordelingen af forskellige stoffer i prøven (d). Figuren er fra [5]. 12 dansk kemi, 98, nr. 6/7, 2017

Side 13

ANALYTISK KEMI/MEDICINALKEMI n label. Det kan således ligeså vel være metabolitter af det oprindelige lægemiddel, som optræder i QWBA-billedet, og i hvor høj grad det er tilfældet afsløres ikke ved et QWBAstudie alene. Billeddannende massespektrometri (MSI) Princippet i MSI er skitseret i figur 1. En prøve scannes linje for linje og punkt for punkt under det sted i massespektrometeret, hvor ioniseringen foregår, og der optages således under eksperimentet et massespektrum i hvert punkt af prøven. Efter et sådant eksperiment af nogle timers varighed har man en samling på tusindvis af massespektre, og ligesom man efter en LC-MS kørsel kan generere adskil- lige ekstraherede ion-chromatogrammer, som viser, hvornår de forskellige stoffer eluerer, kan man med MSI generere billeder for hvert af stofferne – jo højere intensiteten er for det målte stof i et punkt, jo kraftigere farveintensi- tet i den pågældende pixel. Når et højtopløsen- de massespektrometer som f.eks. en Orbitrap benyttes, kan der ofte genereres flere hundrede billeder fra ét eksperiment. Derpå kan man, for at vise fordelingen af stoffer relativt til hin- anden, lave kombinerede billeder, hvor man viser op til tre stoffer sammen, men i hver sin farvekanal (rød, grøn og blå). En af fordelene ved MSI er, at man ikke på forhånd behøver at vide, hvad man kigger efter. Man kan optage et billede i den positive ion-mode, og derpå i sin software bladre igen- nem de forskellige masser, mens fordelingerne af de forskellige detekterede stoffer flyver for- bi på skærmen. Hvis en interessant fordeling viser sig, kan man derpå forsøge at identifice- re, hvilket stof der gemmer sig bag den målte masse (her kan nøjagtig masse-måling og MS/ MS være til stor hjælp). En afgørende fordel ved MSI i forhold til andre imaging-teknikker er selektiviteten i teknikken; selv stoffer med meget store ligheder i strukturen kan skelnes, Figur 2. DESI-MSI analyse af en mus som har fået en intraperitoneal injektion (i bughulen) af 500 µg af det antidepressive lægemiddel amitriptylin 15 minutter før aflivning. Musen snittes på en cryo-microtom (a), og herved opnås 30 µg tynde når blot de har forskellig masse. Det betyder, at når vi laver billeder af lægemidler i forsøgsdyr, så er vi sikre på, at det er det pågældende vævssnit, som kan analyseres med DESI-MSI. Figuren viser vævssnittet efter en H&E lægemiddelstof, vi ser, og ikke en metabolit af farvning med henblik på opnåelse af bedre optisk kontrast (b). Farvningen er udført efter DESI-MSI analysen. DESI-MSI analysen (c) viser tilstedeværelsen af amitriptylin (vist med rødt) i bughulen samt visse steder i fedtlaget under huden. Metabolitten nortriptylin (vist med blåt) ses i leveren og i nyren. For at vise konturen af dyret er et endogent fosfolipid (fosfatidylcholin(34:1)) afbilledet med grønt. Pixelstørrelsen er 480 µm. Figuren er fra [3]. dette, ligesom vi kan lave separate billeder for hver af de enkelte metabolitter. MSI kan basere sig på forskellige ioniseringsteknikker, og de to mest anvendte ioniseringsteknikker til MSI-analyse af biologiske prøver er MALDI og DESI. DESI-MSI benytter sig doseres til en rotte, som efter et givent tidsrum aflives. Derpå af en elektrospray, som udfører en særdeles lokal ekstraktion fryses rotten ned, og der laves tynde vævssnit af dyret, som af analyt fra overfladen efterfulgt af ionisering meget lig den placeres på en fotografisk film, hvorved der som følge af de almindelige elektrospray ionisering, hvor stoffer ioniseres radioaktive henfald fremkommer et billede, som viser forde- direkte fra væskefase. Anvendelsen af en spray til ioniseringen lingen af det indgivne lægemiddel. QWBA er ligesom de fleste er samtidig anledning til den væsentligste begrænsning ved teknikker, som baserer sig på radioaktivitet, særdeles følsom DESI-imaging, nemlig deltaljeringsgraden i billederne, som og kvantitativ, men teknikken har to væsentlige begrænsnin- begrænser sig til ca. 50 µm pga. størrelsen på ioniseringspunk- ger. Dels baserer den sig på en radioaktivt mærket udgave af tet fra sprayen. MALDI-MSI benytter en laser til ioniseringen, lægemidlet, som er både kostbar og tidskrævende at fremstille, og herved opnås en detaljeringsgrad på typisk ca. 20 µm (men i og dels viser QWBA-billeder ikke nødvendigvis fordelingen af visse tilfælde helt ned til 2 µm). MALDI-MSI afhænger dog (til det aktive lægemiddel, men blot fordelingen af den radioaktive forskel fra DESI-MSI) af, at man forud for imaging af prøven dansk kemi, 98, nr. 6/7, 2017 13 t

    ...