Side 12

n ANALYTISK KEMI Separering af CM, VLDL, IDL, LDL og HDL opnås ved at justere densiteten af mediet i et antal centrifugeringstrin for at facilitere en sekventiel ”flydning” af de individuelle lipoprotein-fraktioner [8]. Den fuldstændige adskillelse af alle lipoprotein-fraktioner kan kræve fra to til fem analysedage [9] (figur 3), hvilket begrænser anvendeligheden af metoden som et screeningsværktøj i epidemio­ logiske undersøgelser. Andre metoder til adskillelse og kvantificering af LP inkluderer gelper - meation væskekromatografi (GP-HPLC) og gelelektroforese. GP-HPLC adskil - ler lipoproteiner på basis af partikel- diameteren, hvor små partikler har en længere elueringstid end store partikler [10], mens gelelektroforese er baseret på adskillelse og analyse af makromole- kyler baseret både på deres størrelse og ladning [11]. Begge metoder er temmelig omstændige og derfor heller ikke egnede som screeningsværktøjer. En alternativ og hurtig metode til måling af lipoprote- in-fraktioner er kernemagnetisk reso- nans (NMR) spektroskopi. Bestemmelse af lipoprotein-fordeling fra 1 H NMR-spektre NMR-spektroskopi er fundamentalt set kvantitativ for det målte prøvevolumen, og man kan derfor kvantificere baseli - neopløste signaler ved simpel integra- tion. Selv i komplekse kemiske blan- dinger som blod fungerer dette princip ofte. I lipoprotein-tilfældet (se figur 2) er dette imidlertid ikke muligt, da man i så fald vil kvantificere den totale mængde methylen og/eller methyl i blodet og alt- så ikke molekylære species. Imidlertid er de to indhyldningskurver for methyl og methylen mere end almindeligt kom- plekse og indeholder mange underlig- gende fænomener (kemisk information), der kan relateres til forskellige typer af lipoproteiner. Da det ikke er muligt at opløse disse komplekse indhyldningskurver i bidrag fra enkelte lipoprotein species, kræves der en kalibrering til en referenceme- tode (UC). Til forudsigelse af disse lipoprotein-koncentrationer ud fra 1 H NMR-spektre er der grundlæggende blevet anvendt to metoder til kalibre- ring til referencemetoden, nemlig kur- vetilpasning og PLS-regression (Partial Least Squares) [3,14]. Kvantificering af lipoprotein-fordeling med NMR er der- for vidt forskellig fra andre kvantitative og kvalitative NMR-applikationer, da den bygger på at analysere formen på signalerne fra metyl- og metylen- grupperne. Derfor skal kravene til Figur 3. Sammenligning af målinger af lipoproteiner med referencemetode og med den NMR-baserede prædiktionsmetode. Ultracentrifugeringsmetoden til venstre tager 5-8 dage og NMR-metoden til højre tager kun lidt over en halv time og muliggør dermed større kohorte screeninger. NMR-reproducerbarhed strækkes til dets yderste grænse. Standard Opera- ting Procedures (SOP), der minutiøst beskriver prøveindsamling, forberedel- se, måling og forbehandling, er derfor udviklet for at øge reproducerbarheden på blodanalyser på tværs af forskellige laboratorier [15]. Når disse SOP’er er udviklet, skal der etableres en multiva- riat kalibrering af hundredvis af prøver med tilhørende referencemålinger (UC). Først når dette kalibreringsarbej- de er udført og grundigt valideret, kan man benytte den udviklede kalibre- ringsmodel til at bestemme lipoprotein- fordelingen i plasma ud fra et simpelt 1 H NMR-spektrum (figur 3). Udvikling af en prædiktionsmetode Vi har i samarbejde med Bispebjerg Ho- spital og Institut for Idræt og Ernæring afsluttet et større studium af ældre, der var fokuseret på, om sarkopeni (alders- relateret muskeltab) kan reduceres ved at lave fysisk træning og/eller indtage proteinsupplement (CALM-kohorte) [16]. I den forbindelse har vi foretaget en større kalibrering af 1 H NMR-spektre og lipoprotein-profiler (UC). Dette arbejde er unikt på verdensplan, da det kræver et omfattende analytisk arbejde med referencemetoden UC. Vi har målt både 1 H NMR og UC på blodprøver af 316 sunde, primært ældre, danskere (196 kvinder og 120 mænd) med en alder på 64,5 ± 15 år. Ved at sammenholde disse målinger med Partial Least Squares (PLS) regres- sion har det vist sig, at vi kunne udvikle prædiktionsmodeller for 65 ud af 101 mulige lipoproteiner (hovedfraktioner, subfraktioner og lipoprotein-molekyler) med en prædiktionsnøjagtighed Q 2 større end 0,6 på testsæt-prøver, heraf kunne 41 prædikteres med en Q 2 større end 0,8 [17]. Dette arbejde betyder, at vi nu og fremover kan prædiktere 65 lipoprotein-parametre ud fra et enkelt 1 H NMR-spektrum. Foreløbig har vi testet vores modeller på et uafhængigt prø- vesæt fra en svensk kohorte med 85-95 procent match. Implementering af prædiktionsmetode i software og analytiske perspektiver For at lette fremtidigt analytisk arbejde med LPD-prædiktioner har 12 Dansk Kemi, 105, nr. 4, 2024 -

Side 13

vi implementeret LPD prædiktions­ modellerne i vores open access software SigMa [18], som vi bruger til processering af metabolomics prø- vesæt. SigMa er skrevet i Matlab og kan downloades på https://food.ku.dk/ foodomics. SigMa står for Signature Mapping og er en ny metode, vi har udviklet for at konvertere komplekse NMR-spektre til en kvantitativ meta- bolit-tabel. På denne måde kan vi både opnå en plasma metabolitprofil og en plasma lipoprotein-profil fra samme NMR-spektrum af plasma. Lipoprote- in-profilering giver dermed en ekstra dimension til fremtidige metabolo- mics-studier såsom kostinterventi- onsstudier og andre typer af kliniske screeninger uden ekstraomkostninger. Den eneste betingelse for at opnå den ekstra lipoprotein bonusinformation er at benytte en detaljeret SOP for 1 H NMR prøveforberedelse og måling. Tak til Innovationsfonden for økono- misk støtte til denne forskning. E-mail: Søren B. Engelsen: se@food.ku.dk ANALYTISK KEMI n Referencer 1. H.A. Krebs, Annual Review of Biochemistry 1950 , 19, 409-430. 2. L.C. Smith, H.J. Pownall and A.M. Gotto, Annual Review of Biochemistry 1978 , 47, 751-777. 3. V. Aru, C. Lam, B. Khakimov, H.C.J. Hoefsloot, G. Zwanenburg, M.V. Lind, H. Schafer, J. van Duynhoven, D.M. Jacobs, A.K. Smilde and S.B. Engelsen, Trac-Trends in Analytical Chemistry 2017 , 94, 210-219. 4. R. Carmena, P. Duriez and J.C. Fruchart, Circulation 2004 , 109, 2-7. 5. J. Millán, X. Pintó, A. Muñoz, M. Zúñiga, J. Rubiés-Prat, L.F. Pallardo, L. Masana, A. Mangas, A. Hernández-Mijares, P. González-Santos, J.F. Ascaso and J. Pedro- Botet, Vasc Health Risk Manag 2009 , 5, 757-765. 6. G.F. Lewis and D.J. Rader, Circulation Research 2005 , 96, 1221-1232. 7. W.C. Cromwell and J.D. Otvos, Curr Atheroscler Rep 2004 , 6 , 381-387. 8. T.G. Redgrave, D.C.K. Roberts and C.E. West, Analytical Biochemistry 1975 , 65 , 42-49. 9. S. Monsonis-Centelles, H.C.J. Hoefsloot, S.B. Engelsen, A.K. Smilde and M.V. Lind, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2020 , 58 , 103-115. 10. G. Toshima, Y. Iwama and F. Kimura, 2013 . 11. D.L. Sparks and M.C. Phillips, Journal of Lipid Research 1992 , 33 , 123-130. 12. P.A. Kroon, Journal of Biological Chemistry 1981 , 256 , 5332-5339. 13. J.D. Otvos, E.J. Jeyarajah, D.W. Bennett and R.M. Krauss, Clinical Chemistry 1992 , 38 , 1632-1638. 14. M. Petersen, M. Dyrby, S. Toubro, S.B. Engelsen, L. Nørgaard, H.T. Pedersen and J. Dyerberg, Clinical Chemistry 2005 , 51 , 1457-1461. 15. a) A.C. Dona, B. Jimenez, H. Schafer, E. Humpfer, M. Spraul, M.R. Lewis, J.T.M. Pearce, E. Holmes, J.C. Lindon and J.K. Nicholson, Analytical Chemistry 2014 , 86 , 9887-9894; b) S.M. Centelles, H.C.J. Hoefsloot, B. Khakimov, P. Ebrahimi, M.V. Lind, M. Kristensen, N. de Roo, D.M. Jacobs, J. van Duynhoven, C. Gannet, F. Fang, E. Humpfer, H. Schafer, M. Spraul, S.B. Engelsen and A.K. Smilde, Analytical Chemistry 2017 , 89 , 8004-8012. 16. R.L. Bechshoft, S. Reitelseder, G. Hojfeldt, J.L. Castro-Mejia, B. Khakimov, H.F. Bin Ahmad, M. Kjaer, S.B. Engelsen, S.M.B. Johansen, M.A. Rasmussen, A.J. Lassen, T. Jensen, N. Beyer, A. Serena, F.J.A. Perez- Cueto, D.S. Nielsen, A.P. Jespersen and L. Holm, Trials 2016 , 17 , 17. 17. B. Khakimov, H.C.J. Hoefsloot, N. Mobaraki, V. Aru, M.V. Lind, L. Holm, J. L. Castro-Mejia, D.S. Nielsen, A.K. Smilde and S.B. Engelsen, Analytical Chemistry 2022 , 94 , 628-636. 18. B. Khakimov, N. Mobaraki, A. Trimigno, V. Aru and S.B. Engelsen, Analytica Chimica Acta 2020 , 1108 , 142-151. PREMIUM CHROMATOGRAPHY Boost productivity and generate data confidently with our premium gas and liquid chromatography solutions. Please contact SAMSI, our regional distributor Email: samsi@samsi.no | Phone: +4735975600 www.samsi.no scioninstruments.com - Dansk Kemi, 105, nr. 4, 2024 SCAN FOR MORE INFORMATION 13
    ...