Side 22

n BIOTEKNOLOGI Ny viden om samspillet mellem enzymer i oxidativ nedbrydning af plantebiomasse Oxidativ, enzymkatalyseret nedbrydning af plantebiomasse er et voksende forskningsfelt i forbindelse med enzymatisk nedbrydning og bioraffinering af lignocellulose. Af Caio D.O.G. Silva, Anne S. Meyer og Jane W. Agger, DTU Bioengineering, Danmarks Tekniske Universitet Det komplicerede samspil mellem forskellige oxidative enzymer, der udskilles af skimmelsvampe under biomasse - nedbrydning, har for nylig fået betydelig forskningsmæssig opmærksomhed. I den forbindelse er de kobberholdige lytiske polysaccharid monooxygenaser, LPMOer, en særlig interessant gruppe enzymer, idet de spiller en central rolle i katalysen af den oxidative spaltning af krystallinsk cellulose. Detaljerne i LPMOers katalytiske mekanisme er genstand for intens forsk - ning, især for at forstå, hvordan forsyningen af ​e​ lektroner, der understøtter LPMOernes katalytiske aktivitet, foregår på det molekylære niveau. Ny forståelse af LPMOer Det står nu klart, at LPMOer ikke kun er monooxygenaser, som oprindeligt beskrevet. For at katalysere monooxygenase-reakti­ oner skal LPMOer bruge oxygen til at indføje en hydroxylgrup - pe til et af C-atomerne i forbindelse med den katalytiske spalt - ning af en β-1,4-glykosidbinding i cellulose (figur 1). En sådan hydroxylering fører til destabilisering og efterfølgende spaltning af glykosidbindingen. For at opretholde en kontinuert katalyse kræver monooxygenase-reaktionen, udover ilt, en kontinuerlig tilførsel af elektroner til kobber-ionen i LPMO-enzymets aktive site, konkret kræves 2 e - til hver katalytisk runde (figur 2). Mens man typisk bruger askorbinsyre (vitamin C) som elektrondonor i laboratorieforsøg med LPMO-katalyserede reaktioner, vil elektronerne i naturen skulle komme fra andre kilder. Formentlig forsynes elektronerne enten fra stoffer, som er naturligt til stede i substratet, for eksempel phenoliske kom- ponenter eller andre forbindelser; disse aktiveres sandsynligvis via andre enzymer, som skimmelsvampene udskiller, mens de vokser på plante-biomassen. Alternativt leveres elektronerne direkte fra forskellige reducerende stoffer, som skimmelsvam - pen secernerer. Imidlertid var det længe en gåde, hvordan eksterne elektrondonorer kontinuerligt kan levere elektroner til det aktive site i LPMOer under katalyse med O 2 , og visse detaljer er stadig uklare. Det var et ægte paradigmeskift, da det i 2017 blev vist, at hydrogen peroxid (H 2 O 2 ), snarere end O 2 , er det foretrukne co- substrat til LPMO-katalysen på cellulose, og at H 2 O 2 samtidig eliminerer behovet for forsyningen af elektroner andetstedsfra til den kontinuerlige katalytiske oxidation [1,2]. Til denne såkaldte LPMO peroxygenase-aktivitet leverer H 2 O 2 således også de elektroner, der kræves til cellulosespaltningen, dog undtaget den første indledende elektron, som kræves for at udløse reaktionen. Denne indledende elektrondonation, kaldet ”priming”-reaktionen, er en initieringsreaktion, der er afgø - rende nødvendig for at reducere kobberionen Cu(II) i enzymets aktive site fra enzymets ”hviletilstand” til reaktivt Cu(I), som kræves til katalysen. Priming-reaktionen antages at finde sted, Figur 1. Glykosidbindingsspaltningsreaktion i cellulose katalyseret af LPMO. 22 Dansk Kemi, 104, nr. 6, 2023 -

Side 23

BIOTEKNOLOGI n Figur 2. Panel 1: Skematisk oversigt over forløb af henholdsvis O 2 -drevne og H 2 O 2 -drevne LPMO-reaktioner. Panel 2: Oxidativt reaktionsforløb katalyseret af visse polyphenol oxidaser (eksemplificeret ved Mt PPO7 fra Myceliophthora thermophila ) på guaiacol, et lignin-derivat. Catechol-intermediatet er velegnet til priming af LPMO-enzymer. inden e​​ nzymet binder til cellulose. Vi har for nylig vist, at hvis både cellulose og H 2 O 2 er til stede, kan flere spaltnings - cyklusser udfolde sig efter en enkelt priming-reduktion, fordi Cu(I)-tilstan - den opretholdes ved afslutningen af ​h​ ver cyklus (figur 2) [3]. At opfattelsen oprindeligt var, at LPMOer var oxygenaser, som primært brugte O 2 som substrat, skyldes, at de LPMO-enzymer, som ikke er bundet til cellulose, tilsyneladende selv kan levere små mængder H 2 O 2 via oxida - tion, såfremt O 2 og reduktionsmidler er til stede. Det har senere vist sig, at andre enzymer som svampen udskiller samtidig, for eksempel laccase, lige­ ledes kan producere små mængder H 2 O 2 [4]. Det er klart en mulighed, at denne type H 2 O 2 -produktion kan sætte gang i peroxy­genase LPMO-reaktionen (figur 2). Samlet set indikerer disse observationer, at den oprindelige monooxygenase- aktivitet, som har lagt navn til LPMO- aktiviteten, i virkeligheden er et resultat af peroxygenase-reaktioner, der er dre - vet af H 2 O 2 genereret in situ [2]. tater, der bekræfter paradigmet om, at peroxygenase dominerer over mono­ oxygenaseaktivitet i LPMOer [3]. Vores resultater viser, at ​d​ iphenoler (typisk i form af dihydroxybenzener), effektivt fremmer LPMO-primings-reaktionen, men ikke hverken H 2 O 2 -dannelse via H 2 O 2 spiller central rolle I vores studier af disse enzymreaktioner på DTU har vi for nylig opnået resul - Foto: Pixabay. autooxidation eller LPMO-mono­ oxygenase aktivitet. Disse data under - støtter dermed, at der kræves H 2 O 2 til den LPMO-katalyserede cellulosespalt - ning. Når diphenoler anvendes som reduktionsmidler, er cellulosespaltning med LPMO alene således kun mulig ved eksogen H 2 O 2 -tilførsel. Det særligt interessante ved dette er, at diphenoler såsom 3-methoxycatechol og 3,4-dihydroxy-5-methoxybenzosyre let kan dannes fra lignin-afledte mono - phenoler såsom guaiacol og vanillinsyre via en ortho-hydroxyleringsreaktion katalyseret af fungale polyphenol oxidaser - i vores arbejde konkret med en polyphenoloxidase, Mt PPO7, fra skimmelsvampen Myceliophthora thermophila (svampen kaldes også Thermothelomyces thermophilus). Den konkrete polyphenoloxidase Mt PPO7 katalyserer omdannelsen af metho - xylerede monophenoler, der typisk produceres under svampens lignin- nedbrydning. Vores data tyder på, at polyphenoloxidase-reaktionen kan spille sammen med LPMOer i cellulosened - brydning, udover at aktiviteten i sig selv kan katalysere nye kemiske funktio - naliseringer på lignin og lignin-afledte forbindelser. Opdagelsen betyder med andre ord, at polyphenoloxidasen spiller en rolle i ”priming” af LPMO enzymer - nes kobber, at polyphenoloxidasen ikke deltager i den videre understøttelse af LPMO-aktiviteten, men samtidig kan være et redskab til at funktionalisere lignin-komponenter. Afsløringen af d​ isse reaktioner, er de facto også opdagelsen af en ny skalérbar metode til at kontrollere H 2 O 2 -forsynin - gen til LPMO-katalyse. En kontrolleret forsyning af H 2 O 2 reducerer risikoen for enzyminaktivering, der typisk observe - res, når overskydende H 2 O 2 akkumule- res i reaktionen. Yderligere viden venter forhåbentlig, når vi dykker endnu dybere ned i samspillet mellem forskellige typer oxidative enzymer, der er involveret i at nedbryde plantebiomasse. E-mail: Anne S. Meyer: asme@dtu.dk Referencer/yderligere læsning 1. B. Bissaro, A.K. Røhr, G. Müller, P. Chylensky, M. Skaugen, Z. Forsberg, S.J. Horn, G. Vaaje-Kolstad, V.G.H. Eijsink, Nat Chem Biol. 2017 , 13, 1123-1128. 2. B. Bissaro, V.G.H. Eijsink, Essays Biochem. 2023 , 67 , 575-584. 3. C. De Oliveira, G. Silva, M. Vuillemin, M.A. Kabel, W.J.H. Van Berkel, A.S. Meyer, J.W. Agger, ChemSusChem 2023 , e202300559. 4. V. Perna, A.S. Meyer, J. Holck, L.D. Eltis, V.G.H. Eijsink, J.W. Agger, ACS Sust Chem Eng , 2020 , 8, 831-841. - Dansk Kemi, 104, nr. 6, 2023 23

    ...