n KEMITEKNIK overførslen af substrat igennem enzy - met, og tyrosin går gradvist i opløsning, i takt med at den bliver omdannet til den mere opløselige p -kumarinsyre. Når re - aktionen er til ende, kan de to faser tap - pes hver for sig, og p -kumarinsyren kan udfældes fra polymerfasen ved at sænke pH. De immobiliserede TAL-celler er klar til at blive genbrugt i næste batch, og salt og polymerfasen kan muligvis også genbruges. Fortsat udvikling af processen Mens et forsøg med de immobiliserede TAL-celler beskrevet her, nu er gen - nemført (figur 6), har vi endnu ikke sammenlignet systemet med en kon - trol, hvorfor der endnu ikke foreligger resultater på, hvor effektiv metoden er til Figur 2. Ekstrapoleret produktinhibering baseret på eksperimentielt bestemte kine- tiske parametre for TAL, indsat i den udvidede Michaelis Menten ligning (1). p KS, p -kumarinsyre; Tyr, tyrosin. temperatur, pH og brug af kosolventer (figur 2). Vandigt to-fasesystem til ekstrahering af p -kumarinsyre Vi ønskede en metode til at fjerne p -kumarinsyre in situ , samtidig med at det blev dannet. En typisk metode til in situ produktfjernelse er et to- fasesystem med en organisk fase oven på en vandig fase til ekstrahering af produktet. Dette virker dog ikke for p - kumarinsyre i denne enzymproces, da reaktionen foregår i en basisk opløs - ning, hvor TAL har højere aktivitet og tyrosin har højere opløselighed. I ba - sisk opløsning er p -kumarinsyre ladet og foretrækker den vandige fremfor den organiske fase. Derfor undersøgte vi brugen af et vandigt to-fasesystem til ekstraktionen, som dannes, når to ikke-blandbare polymerer eller en polymer og en salt blandes i en vandig opløsning. Vi afprøvede forskellige salte og polymerer, og fandt, at en opløsning af kaliumfosfat og poly(etylenglykol) dannede et stabilt vandigt to-fasesy - stem samt ekstraherede p -kumarin - syre til den øvre polymerfase med en fordelingskoefficient på op mod 13 afhængig af koncentrationerne. P -ku - marinsyre absorberer lys i det synlige spektrum, hvilket giver det en gylden farve i tilstrækkelige koncentrationer, som let kan observeres med det blotte øje (figur 3). In situ produktfjernelse af p -kumarinsyre Selvom vi har identificeret et effektivt vandigt to-fasesystem til ekstrahering af p -kumarinsyre, var en proces til in situ produktfjernelse endnu ikke på plads, og yderligere udfordringer måtte løses. Det første var at teste TAL-enzymet i saltfasen, da den høje ionstyrke poten - tielt kunne have en negativ virkning på enzymet. Vi opdagede da også et fald i TAL-aktivitet, selv i en 10 procent vægt fosfatopløsning (figur 4), så vi fortyn - dede systemet og identificerede den laveste fosfatkoncentration nødvendig til at bevare to-fasesystemet. Det næste var at bevare enzymet i saltfasen og ude af polymerfasen. I stedet for et oprenset enzym benyttede vi en E. coli -stamme, som udtrykker TAL, men cellerne flød op til polymerfasen på grund af den høje densitet af saltfasen. Vi immobiliserede derfor TAL- cellerne i kugler af en hydrogel (figur 5), så vi kunne pakke dem i en roterende kolonnereaktor (rotating bed reactor) placeret i saltfasen. Typisk pakker man immobiliserede enzymer i en kolonne- reaktor (packed-bed reactor) og pumper substratet igennem kolonnen kontinu - erligt, men dette ville ikke fungere i nærværende enzymproces på grund af den lave opløselighed af tyrosin, som ville give en meget fortyndet produkt - strøm. I stedet benyttede vi en batch- reaktion, hvor tyrosin er til stede i en opslæmning, kolonnen roterer for at øge Figur 3. Det vandige to-fasesystem ekstraherer gyldent p -kumarinsyre til polymerfasen. 22 Dansk Kemi, 104, nr. 5, 2023 -
Download PDF fil
Se arkivet med udgivelser af Dansk Kemi her
TechMedias mange andre fagblade kan læses her