Side 14

n ANALYTISK KEMI/MEDICINALKEMI Figur 3. DESI-MSI analyse af grisehud, som er blevet påført en 5% creme med det lokalbedøvende stof lidokain; figuren viser horisontale snit fra forskellige dybder i huden. Øverst ses DESI billeder med lidokain vist med rødt og metabolitten 3-OH-lidokain vist med grønt. Nederst ses H&E farvninger af de analyserede vævssnit. Det ses, at penetrationen af lidokain er særligt udtalt ved hårfolliklerne (markeret med hf), og at metabolitten især findes i fedtvævet i de dybere lag (markeret med ad). Pixelstørrelsen er 100 µm. Figuren er fra [4]. påfører den et lag matrixmolekyler, som absorberer UV-lyset fra laseren og hjælper med ioniseringen af analytter i prøven. Whole-body imaging med DESI-MSI QWBA har været anvendt i mere end 50 år, og det var derfor oplagt i takt med at de forskellige MSI-teknikker vandt frem inden for de sidste 10-15 år, at teste dem i forhold til den konventionelle QWBA på samme vævssnit. Der er således allerede en række studier, både med DESI- og MALDI-MSI, som netop demonstrerer den markant bedre selektivitet med MSI, men desværre også en følsomhed, som ikke er på niveau med QWBA, idet man ved QWBA i tilfælde af meget små mængder blot kan lade prøven fremkalde i længere tid. Vi havde et ønske om ikke kun at lave MSI på enkelte organer som hidtil i vores arbejde, men også at kunne måle på hele dyr, så helt andre typer studier blev mulige. Udfordringen i denne sammenhæng var ikke selve MSI-analysen – den er ikke så meget anderledes end ellers, blot kører man med noget grovere detaljeringsgrad, da det er en større prøve, som scannes. I stedet var udfordringen fremstillingen af frysesnit, som er meget større og mere heterogene, end når der snittes biopsier eller enkelte organer. I de hidtidige whole-body-studier var frysesnittene blevet lavet på en cryo-macrotom, som er et væsentligt større og dyrere apparat end de cryo-microtomer, som findes på de fleste hospitaler og i mange biomedicinske laboratorier til fremstilling af frysesnit af biopsier og mindre stykker væv. Vi ønskede at udvikle en metode, som kunne fungere med en almindelig cryo-microtom, og løsningen blev at indkøbe en særlig wolframcarbid-klinge, som skærer gennem både knogler og tænder og at opsamle frysesnittene på tape. Metoden begrænser sig til dyr på ca. syv cm længde, hvilket f.eks. gør den anvendelig på voksne hun-mus af C57BL/6 racen. For at få optimal følsomhed udviklede vi en DESI-MSI-me- tode, hvor de endogene stoffer blev målt i full-scan, og sideløbende blev der på samme prøve optaget billeder af lægemiddelstof og en metabolit i MS/MS modus, hvorved disse blev målt med markant højere følsomhed. Et eksempel på resultaterne ses i figur 2, side 13, som viser billeder af en mus doseret med 500 µg af det antidepressive lægemiddel amitriptylin. Lægemidlet blev indgivet i bughulen som en IP-injektion og dyret blev aflivet efter 15 minutter. Det ses, at amitriptylin (vist med rødt) på det tidspunkt primært befinder sig i bughulen, hvor det blev injiceret, men at noget af det allerede har søgt hen i fedtvævet under huden ved ryggen, hvilket kan forklares ved, at amitriptylin er meget lipofilt og ophobes i fedtvæv. Der blev også lavet billeder af nortriptylin (vist med blåt), som er den primære metabolit af amitriptylin, og det viste sig, at den allerede efter 15 minutter er at finde i lever og nyrer. En dosis på 500 µg er i forhold til musens størrelse noget over almindelig terapeutisk dosis, men ret normal i denne type studier, bl.a. pga. metodernes begrænsede følsomhed. I et andet forsøg blev dosis sat ned til 50 µg, hvilket svarer til almindelig terapeutisk dosis (om end denne normalt indgives oralt og ikke IP). Også i dette tilfælde kunne vi detektere både lægemiddelstoffet og metabolitten, hvilket demonstrerer tilstrækkelig følsomhed til klinisk relevante studier. Vi har altså udviklet en særdeles selektiv metode, som kan bruges ved lokalisering af lægemidler og metabolitter i hele dyr, og som er i stand til at afbillede disse sammen med forskellige endogene stoffer, der kan fungere som biomarkører for forskellige vævstyper. Metoden baserer sig på en cryo-microtom til snitning af væv og et ionfælde massespektrometer med DESI-MSI, hvilket også er et billigt instrument i forhold til de fleste MALDI-TOF systemer. Der er alt i alt tale om en relativt low-cost metode til studier, som ellers almindeligvis er forbundet med høje omkostninger. 14 dansk kemi, 98, nr. 6/7, 2017

Side 15

ANALYTISK KEMI/MEDICINALKEMI n Figur 4. Samme type prøve og analyse som i figur 3, med et snit fra 1290 µm dybde, men denne gang analyseret med en pixelstørrelse på 50 µm, som giver en højere detaljeringsgrad. Figuren er fra [4]. DESI-MSI studier af transport og metabolisme af lidokain i hud I et andet projekt benyttede vi DESI-MSI til at undersøge transporten af lægemiddel gennem hud. Det har været diskuteret, hvor stor en rolle folliklerne (hårsækkene) i huden spiller for transporten af lægemidler; nogle har argumenteret for, at de udgør en ubetydelig lille del af hudens overflade og derfor ikke spiller nogen rolle, og andre har hævdet, at de er åbne kanaler ned igennem huden. For at undersøge dette tog vi nogle griseører, barberede dem og smurte dem med en 5% lidokainsalve, og lod det trække over 24 timer. Derpå lavede vi frysesnit af vævet, både som tværsnit og som horisontale snit i forskellige dybder. I vores DESI-MSI analyse af vævet så vi målrettet efter m/z 235, hvor vi ville forvente signalet for lidokain, men i dataanalysen blev vi også opmærksomme på en interessant fordeling af et stof ved m/z 251. Nærmere analyse med MS/MS skulle afsløre, at der var tale om 3-OH-lidokain, altså en metabolit af lidokain, som især lå fordelt i fedtvævet i den dybere del af huden. Dette er eksempel på, hvorledes MSI med sine uventede resultater til tider giver svar på spørgsmål, man end ikke har stillet, idet vi på det tidspunkt mest opfattede metabolisme som noget, der primært sker i leveren og ikke noget, vi havde tænkt os at undersøge i hud. Figur 3 viser horisontale snit af hud i forskellig dybde med fordelingen af lidokain angivet med rød og 3-OH-lidokain i grøn. Som det ses, er det for de dybere snit især omkring folliklerne, at lidokain ses, ligesom det er i fedtvævet i de dybere lag, at 3-OH-lidokain detekteres. Billederne i figur 3 er lavet med en detaljeringsgrad på 100 µm, mens et tilsvarende billede lavet med 50 µm detaljeringsgrad for et snit i 1290 µm dybde ses i figur 4. Billederne viser, hvorledes MSI kan finde anvendelse i drugdelivery studier i forskellige vævstyper. Den rumlige opløsning er ikke på niveau med, hvad der kan opnås med f.eks. fluorescensmikroskopi, men billederne er væsentlig mere stofspecifikke og kan laves for stort set alle lægemidler, uanset om de fluorescerer eller ej. Konklusion Vi har her vist eksempler på, hvor MSI med fordel kan finde anvendelse i moderne lægemiddeludvikling. I whole-body studier er der ikke det store behov for høj detaljeringsgrad, men i stedet høj følsomhed, og her viser DESI-MSI i MS/MS modus sig at være særdeles velegnet. I andre studier inden for drug- delivery vil det være ønskeligt at kunne se mindre detaljer i billedet end de ca. 50 µm, som DESI tillader. Til sådanne studier har vi gavn af nyligt anskaffet udstyr til MALDI imaging med en detaljeringsgrad på helt ned til 5 µm i pixelstørrelse kombineret med en fremragende selektivitet i analysen takket være koblingen til et Orbitrap massespektrometer. Med dette udstyr har vi således igangsat studier af drug delivery gennem hud (fra gris og menneske), kindslimhinde (gris) og tarm (rotte). I sådanne studier kan man følge lægemiddelstoffets vej igennem barrieren og se, hvilken betydning formuleringen har for penetrationen af lægemiddelstoffet. I den sammenhæng er det unikt for MSI, at det er muligt at visualisere fordelingen af ikke kun lægemiddelstoffet, men også eventuelle kemiske penetrationsfremmere i formuleringen sammen med biomarkører for de forskellige celletyper i prøven. Tilsammen giver disse informationer et væsentligt bedre billede af vekselvirkningen mellem stofferne og dermed nye muligheder for at optimere formuleringerne i udviklingen af mere effektive lægemidler i fremtiden. Tak Forfatteren ønsker at takke Forskningsrådet for Natur og Univers (FNU), Forskningsrådet for Sundhed og Sygdom (FSS) og Carlsbergfondet for støtte til anskaffelse af hhv. DESI-MSI ionkilden, MALDI-MSI ionkilden og massespektrometrene benyttet i de omtalte studier. E-mail: Christian Janfelt: christian.janfelt@sund.ku.dk Referencer 1. C. Janfelt, J. Thunig, B. Li, S.H. Hansen, Billeddannende masse­ spektrometri. Dansk Kemi 2012, 93/6-7, 12-14. 2. C. Janfelt, N. Wellner, J. Thunig, H.S. Hansen, S.H. Hansen, Billed­dannende massespektrometri til analyse af vævsprøver. Dansk Kemi 2012, 93/8, 20-23. 3. S. Okutan, H.S. Hansen, C. Janfelt, A simplified approach to cryosection­ ing of mice for whole-body imaging of drugs and metabolites with Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging. Proteomics 2016, 16, 1634-1641. 4. J . D’Alvise, R. Mortensen, S.H. Hansen, C. Janfelt, Detection of follicular transport of lidocaine and metabolism in adipose tissue in pig ear skin by DESI Mass Spectrometry Imaging. Anal. Bioanal. Chem. 2014, 406, 3735-3742. 5. N . Bjarnholt, B. Li, J. D’Alvise, C. Janfelt, Mass spectrometry imaging of plant metabolites – principles and possibilities. Nat. Prod. Rep. 2014, 31, 818–837. dansk kemi, 98, nr. 6/7, 2017 15

    ...