Side 16

Bioteknologi succesfuld strukturopklaring på de fleste NMR-apparater, og det stiller store krav til mængden af råekstrakt og udbyttet ved oprensningsprocessen. Desuden kræver mange marine bakterier store mængder havsalte i dyrkningssubstratet, og da en stor del af de aktive stoffer er så polære, at de ikke kan ekstraheres over i en organisk fase (ethylacetat, dichlormethan osv.), skaber dette store separationsproblemer. Pga. den høje ionstyrke er ionbytning sjældent en mulighed. På CMB har vi fundet, at ionstyrken kan nedsættes markant ved at frysetørre bakteriekulturerne og efterfølgende ekstrahere dem med ethanol, hvori salte kun har en begrænset opløselighed. Arbejdet med polære stoffer er i sig selv en udfordring, da de oftest ikke tilbageholdes under almindelige omvendt fase kromatografibetingelser. Det voksende behov for nye kemikalier med biologisk aktivitet har fremmet arbejdet med mere utraditionelle separationsprincipper, såsom hydrofil interaktionskromatografi (HILIC), der tilbyder en forbedret separation af polære stoffer ved brug af MS-kompatible buffersystemer [8]. HILIC repræsenterer en central oprensningsmetode i arbejdet med Galathea 3-bakterierne. Udvikling af nye oprensningsstrategier Hvis der ikke findes nogen strukturel information omkring målet for en oprensning, før den startes, må oprensningsstrategien udvikles, efterhånden som den skrider frem. Men hvis der stræbes efter at oprense et aktivt stof som i tilfældet med de mange Galathea 3 stammer, kan en manglende oprensningsstrategi resultere i dårligt udbytte og i værste fald et tab af aktivitet i ekstraktet. Derfor arbejdes der på CMB i øjeblikket på at udvikle en såkaldt Explorative Solid Phase Extraction (E-SPE)strategi, hvor SPE-kolonner med komplementær selektivitet indledende afprøves på små prøvemængder, således at der på en hurtig og nem måde kan findes en optimal oprensningsstrategi, før der opskaleres til præparativ skala. Når der kobles til et bioassay kan denne metode afsløre vigtig information om det aktive stofs kemiske egenskaber og mulige funktionelle grupper, der kan optimere den følgende oprensning. Dette kan være ved f.eks. at indføre et oprensningstrin, der fjerner størstedelen af uønskede/ikke aktive komponenter eller selektivt isolerer det aktive stof og stoffer fra samme stofgruppe. For at opnå tilstrækkelig komplementær selektivitet er der til E-SPE udvalgt en stærk anion- og stærk kationbytter, der afslører tilstedeværelsen af sure og basiske stoffer i råekstraktet. En mixed-mode anionbytter er inkluderet, idet den ikke kun tilbageholder stoffer med carboxylsyregrupper, men også phenoler og enoler, hvilket giver supplerende information om funktionaliteter, samtidig med at der opnås en indikation af stoffernes polaritet. Information om komponenternes størrelse fås fra en kolonne pakket med LH-20 dextrangel. Ved analyse af de forskellige fraktioner med LC-MS opnås en elueringsmatrice [9], der viser fordelingen af komponenter og ikke mindst det aktive stof. Dette kan bruges til at fastlægge en oprensningsstrategi, men også afsløre om aktiviteten i ekstraktet stammer fra et enkelt stof eller flere forskellige. Denne form for præfraktionering har flere fordele. Stoffer med samme polaritet kan være svære at adskille ved almindelig kromatografi, og potentielle kandidater kan nemt overses. E-SPE skaber fraktioner med færre komponenter, og ved en krydssammenligning mellem de aktive fraktioner er det muligt at skære antallet af kandidater betragteligt ned. Kompleksiteten af råekstrakterne kan ligeledes forårsage problemer, når disse skal testes i bioassays, f.eks. kan tilstedeværelsen af salt, fedstoffer og andre mediekomponenter maskere bioaktiviteten og dermed formindske muligheden for at denne opdages under screening [10]. En grov adskillelse og opkoncentrering af ekstraktets komponenter som ved E-SPE kan afsløre aktive stoffer, dansk kemi, 89, nr. 11, 008 Figur 5. Eksempel på fordele ved at lave en oprensningsstrategi ud fra E-SPE: Pseudoalteromonas luteoviolacea producerer flere forskellige stoffer med antibakteriel aktivitet, hvoraf violacein og en korormycin analog er kendte. Elueringsmatricen til venstre viser distributionen af antibakterielle stoffer som fundet i assay med Vibrio anguillarum og ved MS-analyse. I de fleste fraktioner kan aktiviteten tilbageføres til korormycin 1c (violacein er ikke aktiv mod gram-negative bakterier som Vibrio), undtagen én af fraktionerne fra MAX kolonnen, hvor der observeres aktivitet uden tilstedeværelsen af allerede kendte bakteriehæmmende stoffer. Dette afslører endnu et aktivt stof, der ellers nemt ville blive overset. Desuden afslører E-SPE, at dette nye stof formentlig indeholder en sur funktionalitet bortset fra en carboxylsyre (phenol eller enol), da det aktive stof tilbageholdes på en MAX-kolonne, men ikke på en almindelig SAX. der ellers ville være overset. Ikke mindst giver E-SPE mulighed for at analysere de indsamlede bakterier med en effektiv og standardiseret metode. Perspektivering og fremtidigt arbejde Udforskning og udnyttelse af marine bakteriers bioaktive stoffer er et spændende felt og indgår i marin bioteknologi eller ”blå bioteknologi”. Dette felt har stor bevågenhed bl.a. i EU. Man kan kun til fulde forstå og udnytte det materiale, vi har indsamlet, hvis mange forskellige kræfter kombineres. Ikke kun marin mikrobiologi og naturstofkemi er nødvendig – men andre typer af ekspertise må inddrages – f.eks. cellebiologi og proceskemi. Et stort team af forskere tager del i arbejdet. DTU Aqua ved Lone Gram er ansvarlige for flere af de mikrobiologiske analyser, herunder evaluering af det biologiske baggrundsmateriale samt de betingelser, der fremmer bakteriernes produktion af aktive stoffer. Naturstofkemigruppen (Thomas O. Larsen) på CMB er hovedansvarlige for at identificere bakteriernes aktive komponenter, herunder oprensning og strukturopklaring af de aktive stoffer. Derudover vil det blive undersøgt, hvorvidt de sygdomsfremkaldende egenskaber hos Staphylococcus aureus eller Pseudomonas aeruginosa hæmmes af de aktive stoffer (professor Hanne Ingmer, KU-Life, lektor Birgitte Kallipolitis, SDU, professor Michael Givskov, KU), og hvorvidt de aktive stoffer påvirker immunceller og virker antiinflammatorisk (professor Hanne Frøkiær, KU-Life). Eventuelle bivirkninger i form af toksicitet (SDU og KU) og resistensudvikling (DTU Aqua) undersøges. Det vil tillige blive undersøgt, hvordan de indsamlede bakterier og deres aktive stoffer kan bruges som konserveringsmidler i fødevarer (Chr. Hansen A/S). Sidst men ikke mindst deltager filmselskabet Nature&Science, der via webbaseret materiale (www.videnskab.dk), filmklip og udarbejdelse af en dokumentarudsendelse formidler forskningen i et lidt bredere perspektiv. Galathea 3-ekspeditionen har givet os mulighed for at etablere en helt unik, global samling af biologisk aktive marine bakterier, og vi tror, at arbejdet vil dokumentere havets poten- 16

Side 17

Bioteknologi tiale som kilde til nye biologisk aktive stoffer. Vi tror, at vi med projektet er med til at starte en stærk dansk platform inden for ”blå bioteknologi” og håber, at vi hermed kan åbne for andre både nationale og internationale kontakter. E-mail-adresser: Maria Johansen: maj@bio.dtu.dk Lone Gram: gram@aqua.dtu.dk Referencer 1. Engel, S.; Jensen, P. R.; Fenical, W. Journal of Chemical Ecology 2002, 28(10), 1971-1985. 2. Sundin, G. W.; Jacobs, J. L. Microbial Ecology 1999, 38(1), 27-38. 3. Zobell, C. E. Journal of Bacteriology 1943, 46(1), 39-56. 4. Cooksey, K. E.; Wigglesworthcooksey, B. Aquatic Microbial Ecology 1995, 9(1), 87-96. 5. Elyakov, G. B.; Stonik, V. A. Russian Chemical Bulletin 2003, 52(1), 1-19. 6. Haefner, B. Drug Discovery Today 2003, 8(12), 536-544. 7. Larsen, T. O.; Smedsgaard, J.; Nielsen, K. F.; Hansen, M. E.; Frisvad, J. C. Natural Product Reports 2005, 22(6), 672-695. 8. Hemstrom, P.; Irgum, K. Journal of Separation Science 2006, 29(12), 1784-1821. 9. Cardellina, J. H.; Munro, M. H. G.; Fuller, R. W.; Manfredi, K. P.; Mckee, T. C.; Tischler, M.; Bokesch, H. R.; Gustafson, K. R.; Beutler, J. A.; Boyd, M. R. Journal of Natural Products 1993, 56(7), 1123-1129. 10. Appleton, D. R.; Buss, A. D.; Butler, M. S. Chimia 2007, 61(6), 327-331. Nyt om. … Mariehønens lugt Vi forbinder normalt biller med noget ubehageligt; men den plettede mariehøne har vores sympati. Den har imidlertid en ubehagelig lugt, hvad der normalt ikke volder os store problemer. Hvis de optræder i større tal i vinmarker og kommer med i vinen, kan det imidlertid give vinen en ubehagelig afsmag. En gruppe forskere ved Iowa State University har undersøgt mariehønens lugtstoffer og fundet ud af at lugten skyldes en række pyraziner bl.a. 2,5-dimethyl-3-methoxypyrazin DMMP og 2-isopropyl-3methoxypyrazin IPMP. Carl Th. Determination of characteristic odorants from Harmonia axyrides beatels, Journal of Chromatography A, 1147, 2007 side 66 kort nyt MI L ¨ IN T EG -Q LI lrlm^f R AL Skinnet bedrager Sådan stod der at læse i Politiken i en artikel om Tingbjerg1/10 2008. Det fik mig op af stolen, for jeg havde altid troet, at det hed ”skindet bedrager”, min kone var enig med mig heri. Google måtte vel give mig ret, men nej også her finder man formen, men også min gode gamle form – såvel som et væddemål om hvad der er det rigtige. Og udtrykket giver jo god mening. Jeg kom til at tænke på, at jeg en gang i min pure ungdom fandt et flot stykke svovlkis – ved Stevns Klint så vidt jeg husker – og troede, at jeg havde fundet guld. Men min fysik/kemilærer i folkeskolen slog mig koldt vand i blodet, for han kendte godt mineralet og kunne fortælle, at det hed svovlkis, og at det intet havde med guld at gøre. Skinnet bedrog mig med andre ord. Men hvorfor er det nu lige, at svovlkis ligner guld? Guld må være gult, fordi der er en elektronisk overgang i guldatomet, der absorberer ude i det blå – komplementarfarven til gul. Men hvad har svovlkis at gøre godt med? Iflg. K.A. Jensens Almen Kemi er svovlkis=pyrit= jernkis=FeS2 et salt af Fe2+ med disulfidionen S22-. Det må være denne ion,som er skyld i den gule farve, igen fordi den har en elektronisk overgang ude i det blå. Svovl er jo ikke ubekendt med at fremtræde gult. Alt dette sker jo i overfladen af metallet/mineralet. Man kunne måske sige at skindet bedrager? p' ^` fb eebih bgm k^'\hf( INTEGRERET TANKEGANG? Ultimativ renhed og effektivitet. HVURe\`^SZ_VcVUV_U`\f^V_eVcVe `gVc]VX_V7]Zi eV\_`]`XZ^VUUV_SVUdeV ?Z]]ZC ]¡d_Z_XZdZ_\]RddV\R_UVe_jV ?Z]]ZC;_eVXcR]gR_UcV_d_Z_XddjdeV^ eZ]SjUVUVeYV]V 6VeeV_jV?Z]]ZCdjdeV^ ac`UfTVcVcS|UVcV_e`Xf]ecRcV_e gR_Uf_UVcecj\UZcV\eVWcRYR_VgR_U YgZ]\VeXZgVcUZX\`^a]Ve\`_ec`]`gVc gR_UVeZUZe]RS`cRe`cZf^dR^eaVcWV\e SV\gV^^V]ZXYVUZW`c^RWdVaRcReV eRaaVdeVUVcBA6±Vc ?Z]]ZC;_eVXcR] djdeV^ thorvald Pedersen ADVANCING LIFE SCIENCE TOGETHERª 9|Z_Ua|www.millipore.com/integral W`cjUVc]ZXVcV`a]jd_Z_XVc`^UVeeV`XR_UcV ^|UVc?Z]]Za`cVf_UVcde¡eeVc]ZWVdTZV_TV W`cd\_Z_Xa| AaeZ]ecVBA6V_YVUVc 17 dansk kemi, 89, nr. 11, 008 kZ e pp
    ...