Side 14

Bioteknologi Figur 2. Ekstrakter af forskellige pigmenterede Pseudoalteromonas stammer. Foto: CMB, DTU Systems Biology. ompodning og dyrkning mister egenskaben. Vi koncentrerer os om de bakterier, hvor bioaktiviteten er stabil og gentagelig. Vi ved ikke, hvorfor bakterierne producerer deres flotte farvestoffer. En teori er, at pigmentet beskytter dem mod solens UV-stråler, der forårsager mutationer i DNA [2]. Så kan bakterien vokse tættere på havoverfladen, hvor næringsniveauet er højere [3,4], men solens stråling mere intens. Kombinationen af pigment og hæmmende aktivitet er formodentlig med til at tilpasse Pseudoalteromonas til det marine økosystem. Deres succes og udbredelse understreges af, at arter fra slægten blev isoleret under hele Galathea 3-ruten. cerer under veldefinerede vækstbetingelser. På den måde kan man udvælge stammer, der er repræsentative for en hel gruppe af bakterier, således at man undgår at screene et meget stort antal kemisk næsten ens organismer. Når den ”lokale kemi” skal undersøges, dykkes der ned i de enkelte stoffer, en bakterie producerer. Ved at gennemsøge databaser for naturstoffer med samme akkurate molekylmasse (ud til 3. eller 4. decimal) og isotopmønster er det muligt at give en sandsynlighed for, om det enkelte stof er nyt. Derved undgår man at bruge tid og energi på at isolere og identificere allerede kendte stoffer, og dermed forøges raten af ubeskrevne metabolitter markant [7]. Marine naturstoffer Den samlede mængde af sekundære metabolitter, som en mikroorganisme producerer, er produktet af genmaterialet og påvirkninger fra økosystemet, idet evnen til at producere disse stoffer afspejler organismernes mulighed for at overleve i dette habitat. Marine mikroorganismer er kendte for at producere unikke metabolitter, der har nogle hyppige fællestræk. Ofte integreres elementer fra havmiljøet i de producerede stoffer, hvilket gør halogenerede stoffer (særligt bromerede) mere hyppige sammenlignet med stoffer isoleret fra andre organismer. Desuden er en større del af stofferne vandopløselige, hvilket betyder en større frekvens af polære glykosider, alkaloider og forskellige typer af polyhydroxylerede stoffer [5]. Da stofferne hurtigt bliver fortyndet i vandet, er de aktive stoffer ofte meget potente [5,6]. Det er denne potens, der gør marine naturstoffer til attraktive kandidater til nye lægemidler eller som aktive komponenter i teknologiske sammenhænge. Nye marine udfordringer Arbejdet med marine bakterier rummer særlige udfordringer for mikrobiologer såvel som kemikere. De aktive stoffer er ofte meget potente, og de produceres i meget små mængder (<100 µg/L kultur under optimale forhold). Trods store fremskridt inden for NMR-teknologi, kræves der stadig 0,5-1 mg stof for Dereplikering og prioritering af ekstrakter Det er vigtigt i en meget tidlig fase at skelne mellem potentielt interessante, uudforskede grupper af mikroorganismer og velkendte organismer, da førstnævnte repræsenterer den størst mulige kemiske og biologiske diversitet og dermed giver mulighed for nye opdagelser. Vi står med et meget stort materiale - flere hundrede renkulturer af bakterier – og det er derfor specielt vigtigt at få sorteret og prioriteret materialet, så vi fokuserer på de nye og ukendte stoffer. Processen med at identificere allerede kendte stoffer kaldes dereplikering. Den baseres på CMB, primært på tolkning af data fra væskekromatografi koblet til UV-detektion og massespektrometri (LC-UV-MS). Der skelnes mellem dereplikering på globalt og lokalkemisk niveau. Globalt set evalueres bakterierne ud fra deres metabolitprofil, altså den samlede kombination af stoffer, den enkelte bakterie produdansk kemi, 89, nr. 11, 008 Figur 3. Stoffer med antibakteriel effekt isoleret fra Pseudoalteromonas: Korormicin (1), norharman (2), bromophen (3), pentabromopseudilin (4) og violacein (5). 14

Side 15

Bioteknologi Thurne Teknik Danmark introducerer: Krauss-Maffei Dynamic Crossflow Filtration Crossflow metoden anvendes for separering af stoffer, hvor suspensionens egenskaber vanskeliggør en filtrering. I applikationer med opløsningsmidler, slidende substanser mv. er keramiske filtre ofte anvendt. I den klassiske crossflow filtrering, vil fødestrømmen løbe over membranen, så man til dels undgår en tilstopning. KMPT AG har videreudviklet denne proces og kalder den Dynamic Crossflow Filtration. I denne proces vil de roterende keramiske diske generere et turbulent differential flow af fødestrømmen. Herved undgås et blokerende lag, der får filteret til at stoppe til. Muligheden for en opkoncentrering af retentatet til en viskositet på 700 mPas åbner op for nye typer af applikationer. Ved brug af keramiske diske spænder separationen fra nano- til partikelfiltrering (7 nm til 100 µm) Fordelene ved Krauss-Maffei Crossflow Filter DCF • 80 % reduktion i energiforbruget, bl.a. pga. lav eller ikkeeksisterende køling af suspension • Mulighed for filtrering af produkter på op til 700 mPas • Uforlignelig fleksibillitet i designet Feed n n Permeate Concentrate Membrane Rotation of shafts For yderligere info, kontakt venligst: Thurne Teknik Danmark, Kronprinsessegade 46E, 1306 Kbh. K. Tlf.: +4533737142 E-mail: louise.skovgaard@thurne.dk 15 dansk kemi, 89, nr. 11, 008 t Figur 4. Princippet i dereplikering på global- og lokalkemisk niveau. Yderst til venstre ses et fylogenetisk træ baseret på 16S-rDNA sekvenser af de pigmenterede Pseudoalteromonas stammer. I stedet for at undersøge mange stammer fra hver gruppe, udvælges repræsentative stammer (sorte bokse). For de udvalgte stammer bliver der gået i dybden med de enkelt metabolitter, der observeres i bakterieekstraktets ionkromatogram (midten af figuren). De enkelte stoffers akkurate masse findes ved analyse af de tilhørende massespektre (yderst højre), og disse bruges til at gennemsøge naturstofsdatabaser for stoffer med samme masse. Findes der en sandsynlig kandidat i databasen, bliver der ikke gået videre med denne metabolit. I stedet fokuseres oprensningen på metabolitter der højst sandsynligt er ukendte.
    ...