n MIKROSKOPI Der er dog en grundlæggende begrænsning ved at studere proteiners mekanisme ved hjælp af krystallografi: Man kan kun lave modeller, hvor proteinet står stille. Hvis man forestiller sig en gammeldags vandpumpe, så svarer det til, at man kan tage et billede, når håndtaget er oppe eller nede. Men man kan aldrig få en video, mens der pumpes. For pumper er det bevægelserne, der definerer funktionen, og derfor kan den beskrives meget bedre ved en video frem for enkeltbilleder. Forudsætningen for at se et molekyles bevægelser direkte er, at man har en teknik, der er følsom nok til at se enkelte molekyler. De fleste eksperimentelle teknikker måler på milliarder af molekyler samtidigt. Da molekylerne ikke bevæger sig i takt, vil sådanne gennemsnitsmålinger udviske informationen om bevægelsen. Fluorescensmikroskopi er følsomt nok til at ”se” et enkelt molekyle, og kan bruges til at måle bevægelser i et enkelt molekyle. Fornyeligt har vi brugt denne teknik til at filme ionpumper, imens de pumper [1]. Figur 3. Enkelt-molekyle målinger af afstande internt i et enkelt molekyle vha. FRET. De abrupte ændringer i FRET-værdien svarer til skift imellem tilstande, hvor pumpen er åben indad og udad. Pump fiction Vi ville gerne bruge enkelt-molekyle-studier til at besvare en række uafklarede spørgsmål omkring pumpernes funktion. Først og fremmest ville vi gerne forstå, hvordan de pumper i en retning. Da pumperne skal kunne opbygge koncentrationsforskelle på flere tusinde fold, ville det være ødelæggende, hvis de kører en lille smule i den forkerte retning. Vi forventede, at pumpens retning var bestemt af kløvningen af den energirige binding i ATP. Det viste sig dog ikke at holde stik. Til vores store overraskelse viste det sig, at proteinet kan kløve bindingen i ATP for derefter at genskabe den igen. Proteinet kan dermed genskabe sit kemiske brændstof, hvilket svarer til en motor, der laver benzin ved at køre baglæns! I stedet bliver pumpens cyklus irreversibel i det øjeblik, den giver slip på det brugte ATP. Vi kender flere mellemstadier i pumpernes cyklus, men det er umuligt at se, om man har beskrevet alle tilstande, før man ser, hvordan proteinet bevæger sig. For eksempel var det blevet foreslået, at proteinet ventede i et stadie, hvor det hverken var åbent indad eller udad, hvilket dog aldrig var blevet observeret direkte. Ved at sænke pumpens hastighed kunne vi se dette stadie direkte i vores målinger. Dette mellemstadie svarer til det sidste punkt i cyklussen, hvor pumpen stadig kan vende om og køre baglæns. Hvor ofte en celle kan sende signaler, afhænger blandt andet af, hvor hurtigt den kan re-etablere sine ion-gradienter. Derfor var det også vigtigt at forstå, hvad der begrænser, hvor hurtigt pumpen kan køre. Det er det langsomste trin i processen, der afgør, hvor hurtigt pumpen kan køre. Ved at følge pumpens bevægelser kunne vi måle, hvor længe hvert trin tager, og dermed bestemme, hvad der er det begrænsende trin. Overraskende nok sker de store ændringer af molekylets struktur næsten øjeblikkeligt. I hvert fald hurtigere end vores kamera kan følge med til. Vi fandt, at det begrænsende trin rent faktisk var kemien i overførslen af en fosfat-gruppe fra ATP til pumpen. ”Og hvad kan man så bruge det til?” Vi er alle født med omkring 50 nye ændringer i vores genom oveni dem, vi arver fra vores forældre. Af og til rammer sådanne mutationer et gen, som indeholder instruktionerne til et vigtigt protein som for eksempel en ionpumpe. En enkelt mutation kan ødelægge pumpen, så den ikke kan pumpe rigtigt. Dette kan ændre ionbalancen i vores celler og forstyrrer dermed indirekte alle processer, der udnytter ion-gradienter. Fornyeligt er det blevet opdaget, at muterede ionpumper er skyld i flere genetiske sygdomme som for eksempel halvsidig migræne og en aggressiv form for Parkinsons. Hvis man havde et lægemiddel, der kunne rette op på pumpens funktion, så kunne det være en effektiv behandling. Forudsætningen for kunne udvikle sådan et molekyle er, at vi præcist forstår, hvilken effekt mutationerne har. Vi håber, at enkelt-molekyle-målinger af ionpumper kan bidrage til at forstå, hvordan mutationer påvirker pumpernes egenskaber. Før vi kan teste effekten af mutationer, har vi dog et stykke grundvidenskabeligt arbejde foran os. Af tekniske årsager blev vores første enkelt-molekyle målinger lavet på en calciumpumpe fra bakterien Listeria. For at vi kan teste effekterne af sygdomsmutationer, bliver vi først nødt til at kunne lave samme type målinger i de tilsvarende proteiner fra pattedyr. Samtidig vil vi gerne kunne måle på flere forskellige typer af pumper. Derfor arbejder vores forskningsgruppe i øjeblikket på at udføre samme type forsøg på forskellige typer af pumper. Enkelt-molekylestudierne blev startet i grundforskningscenteret Pumpkin, og videreført med støtte fra blandt andet Lundbeckfonden og Det Frie Forskningsråd. E-mail: Magnus Kjærgaard: magnus@inano.au.dk Originalartikel 1. Dyla, M. et al. Nature 551, 346–351 (2017) 12 Dansk Kemi, 99, nr. 8, 2018 -
Download PDF fil
Se arkivet med udgivelser af Dansk Kemi her
TechMedias mange andre fagblade kan læses her