BIOTEKNOLOGI n n Enzymatiske katalysatorer i HMO-produktion Glykosylhydrolaser (GH): Fra et aktiveret donorsubstrat (f.eks. naturligt forekommende di-/oligo-/polysakkarid eller p-nitrophenyl glykosid) kan GH katalysere transglykosylering i konkurrence med hydrolyse af donorsubstratet. Ofte er transglykosyleringsproduktet også substrat for en efterfølgende hydrolyse. Produktudbyttet afhænger således af balancen mellem enzymets transglykosyleringsaktivitet og dets hydrolyseaktivitet, og kan bl.a. forøges ved at anvende en høj acceptorkoncentration. Transglykosidaser (TG): Egentlig GH, hvor hydrolyseaktiviteten er (stort set) fraværende. Forholdsvist sjældne i naturen, især inden for HMOstrukturer. Dog findes et enkelt velstuderet eksempel, nemlig transsialidaser fra Trypanosoma-parasitter - mest kendt er transsialidasen fra Trypnosoma cruzi. Glykosyltransferaser (GT): Katalyserer HMO-syntesen in vivo. Kræver nukleotidaktiverede donormolekyler og er ofte membranbundne - og derfor vanskelige at arbejde med in vitro. Glykosyntaser (GS): Ved substitution af den katalytiske nukleofil med en ikkenukleofil aminosyre fjernes hydrolyseaktiviteten fra GH. GS anvender gerne glykosylfluorider som substrater. α-LFukosynthaser benytter syntestisk β-fukosylfluorid, som er ustabilt. Syntetisk β-fukosylazid er et alternativ. Genetisk modificeret E. coli: Gennem en række knock-in af gener for f.eks. glykosyltransferaser og transportere til at få substrat ind og produkt ud af cellen samt knock-out af bl.a. lacZ β-galactosidase, kan simple HMO-strukturer som 2’FL produceres ved fermentering. graminearum: FgFCO1 katalyserede dannelsen af 2’FL - den mest udbredte HMO - med fukosyleret xyloglukan som fukosyldonor og laktose som acceptor, figur 1. Udbyttet var 8% efter fire timer og 14% efter 24 timer [6]. FgFCO1 havde lav hydrolyseaktivitet på 2’FL, og derfor faldt produktbyttet ikke i løbet af de 24 timers reaktion, som det ellers ofte er tilfældet med glykosidase-katalyseret transglykosylering. Ny fukosidase med høj transfukosyleringsaktivitet For nyligt blev tre nye fukosidaser fra patogene Clostridium perfringens ATCC 13124 beskrevet [7]. Én af dem - CpAfc2 - havde hydrolytisk aktivitet på HMO-lignende strukturer og blev klassificeret som medlem af GH29 underfamilie B, der indeholder α-1,3/4-fukosidaser, som specifikt er aktive på forgrenede α-1,3- og α-1,4-fukosyleringer. I vores nye studie [6] viste vi, at rekombinant CpAfc2 katalyserede dannelsen af LNFP II fra 3FL og LNT med et udbytte på 34-39%. Dette er et langt højere udbytte, end hvad der er rapporteret for to native α-L-1,3-fukosidaser fra Bifidobacterium sp. og på niveau med hvad der er opnået med en genetisk modificeret variant af α-L-1,3/4-fukosidase fra Bifidobacterium longum subsp. infantis [6,8]. Det er således sandsynligt, at flere effektive transfukosidaser kan identificeres, selvom ingen i dag er kendte. Selvom det er to kostbare HMO-strukturer (3FL og LNT), der er i brug som substrater, kan der med denne metode opnås en blanding med tre forskellige HMO-strukturer, nemlig LNT, 3FL og LNFP II. LNT er som nævnt blandt de tre mest udbredte HMO-strukturer generelt, mens den mere komplekse LNFP II er den næstmest udbredte i modermælk fra de ca. 20% ”ikke-udskillere”. Mens fermentering af modificeret E. coli med rimeligt udbytte af LNT og 3FL er beskrevet, er det hidtil ikke lykkedes at producere den mere komplekse LNFP II ved fermentering [3,5]. En kombination af fermentering og fukosidase-katalyseret transfukosylering er således en oplagt mulighed. Vores forskning i enzymatisk transfukosylering er støttet af Det Frie Forskningsråd - Teknologi og Produktion (bevilling til BZ). E-mail: Birgitte Zeuner: biz@kt.dtu.dk Anne S. Meyer: am@kt.dtu.dk Referencer 1. Bode L. Human milk oligosaccharides: Every baby needs a sugar mama. Glycobiology 2012; 22: 1147-1162. 2. Kunz C, Meyer C, Collado YC, Geiger L, Garcia-Mantrana Y, Bertua- Rios Z, Martinez-Costa Z, Borsch C, Rudloff S. Influence of gestational age, secretor, and Lewis blood group status on the oligosaccharide content of human milk. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 2017; 64: 789-798. 3. Sprenger GA, Baumgärtner F, Albermann C. Production of human milk oligosaccharides by enzymatic and whole-cell microbial biotransformations. Journal of Biotechnology 2017; 258: 79-91. 4. Bode L, Contractor N, Barile D, Pohl N, Prudden AR, Boons GJ, Jin YS, Jennewein S. Overcoming the limited availability of human milk oligosaccharides: challenges and opportunities for research and application. Nutrition Reviews 2016; 74: 635-644. 5. Petschacher B, Nidetzky B. Biotechnological production of fucosylated human milk oligosaccharides: Prokaryotic fucosyltransferases and their use in biocatalytic cascades or whole cell conversion systems. Journal of Biotechnology 2016; 235: 61-83. 6. Zeuner B, Muschiol J, Holck J, Lezyk M, Gedde MR, Jers C, Mikkelsen JD, Meyer AS. Substrate specificity and transfucosylation activity of GH29 α-L-fucosidases for enzymatic production of human milk oligosaccharides. New Biotechnology 2018; 41: 34-45. 7. Fan S, Zhang H, Chen X, Lu L, Xu L, Xiao M. Cloning, characterization, and production of three α-L-fucosidases from Clostridium perfringens ATCC 13124. Journal of Basic Microbiology 2016; 56: 347-357. 8. Saumonneau A, Champion E, Peltier-Pain P, Molnar-Gabor D, Hendrickx J, Tran V, Hederos M, Dekany G, Tellier C. Design of an α-Ltransfucosidase for the synthesis of fucosylated HMOs. Glycobiology 2016; 26: 261-269. Pipetteservice Akkrediteret kalibrering Reparation • Vedligeholdelse Gilson Center of Excellence • Certificerede teknikere • 20 års erfaring • Alle førende fabrikater • Elektroniske certifikater • Serviceaftaler Biolab A/S, Sindalsvej 29, DK-8240 Risskov, Tlf: 8621 2866 Fax: 8621 2301 E-mail: pipetteservice@biolab.dk www.biolab.dk Cal. Reg. Nr. 482 - Dansk Kemi, 99, nr. 2, 2018 17
Download PDF fil
Se arkivet med udgivelser af Dansk Kemi her
TechMedias mange andre fagblade kan læses her